نام اختصاری: CMV Quant PCR  

سایر نام ها: تشخیص کمی CMV با روش PCR

Cytomegalovirus Quant, Cytomegalovirus PCR, Cytomegalovirus amplified probe technique, HHV-5, Human herpesvirus 5

 

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: ادرار، سرم، پلاسما، لنفوسیت های خون محیطی، مایع نخاع (CSF)، مایع BAL، مغز استخوان و بافت های گوناگون از جمله ریه و مغز. برای ردیابی عفونت های مادرزادی توصیه می شود از مایع آمنیوتی جهت ردیابی DNA ویروس استفاده شود.

حجم نمونه مورد نیاز:

ü      ۵ ml نمونه ادرار و خون،

ü      ۱ ml سرم، پلاسما، مایع نخاع و سایر مایعات بدن

شرایط نمونه گیری:

1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1. لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های جمع کننده یا پلاستیکی استریل صورت گیرد و برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود.
2. ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.
3. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
4. از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
5. پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC 20- نگهداری شود.
6. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
7. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
8. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل ۷۰% و یا وایتکس ۱۰% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
2. قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
3. در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از ۱۰ واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

1. سرم یا پلاسما باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری جدا سازی شده و تا زمان انجام  آزمایش، در دمای ºC 20 – نگهداری شود. سایر نمونه های مورد استفاده نیز باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای ºC 20- قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
2. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
3. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در ۲۴ ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20 – فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

تشخیص زود هنگام عفونت ویروسی و اقدام برای درمان به موقع بیماری، پیش بینی وضعیت بیمار و پاسخ به درمان علیه ویروس سایتومگال.

اطلاعات تکمیلی:

سیتومگالوویروس ها از خانواده هرپس ویروس ها می باشند که در همه جا پراکنده بوده و عوامل شایعی از بیماری در انسان می باشند. نام کلاسیک بیماری حاصل از ویروس، انکلوزیون سیتومگالیک است واین نام گذاری به دلیل بزرگ شدن سلول های آلوده به ویروس می باشد. سیتومگالوویروس، از نظر محتویات ژنتیکی غنی ترین ویروس در خانواده هرپس ویروسهای انسانی است و تنها تعداد کمی از پروتئین های کد شونده توسط ویروس شناخته شده اند. یکی از آنها به عنوان گیرنده FC به گلیکوپروتئین سطحی سلول می چسبد و قادر است به طور غیر اختصاصی به بخش FC ایمونوگلوبولین متصل شود. این امر ممکن است به سلول های آلوده کمک کند تا با فراهم ساختن نوعی ایمونوگلوبولین غیر اختصاصی به عنوان پوشش حفاظتی، از دسترس سیستم ایمنی میزبان در امان بمانند.

CMV در اشخاص آلوده به ویروس، در خون، بافتها و تقریباً تمام مایعات بدن یافت شده است. انتقال ویروس می تواند از طریق دهانی، جنسی، انتقال خون یا پیوند عضو، داخل رحمی و یا مادر به جنین صورت گیرد. عفونت با CMV عموما به یک عفونت بدون علامت منتهی می شود و ویروس در طول زندگی فرد به طور مخفی در بدن باقی می ماند. عفونت ویروسی در صورت ایجاد علائم در کودکان یا بالغین، علائمی شبیه به منونوکلئوز همراه با تب و هپاتیت ضعیف ایجاد می کند. عفونت مادرزادی ممکن است منجر به مرگ جنین شود. همچنین در بیمارانی با نقص سیستم ایمنی نظیر افراد مبتلا به ایدز، افرادی که پیوند عضو دریافت کرده اند و افرادی که تومورهای بدخیم دارند و ناچارند داروهای مختل کننده ایمنی دریافت کنند، عفونت ویروسی، علائم شدیدتری را نسبت به افراد طبیعی ایجاد می کند.

روش مرجع:

روش ارجح: ردیابی ژنوم ویروس به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

سایر روشها: کشت ویروسی از نمونه های ادرار، بزاق، بافت اپیتلیال گلو و یا سایر بافت های بدن، تست های سرولوژیکی که آنتی بادی های IgG و IgM علیه ویروس را ردیابی می کند، تست ELISA جهت اندازه گیری آنتی بادی،Various fluorescence assays و هماگلوتیناسیون غیر مستقیم و آگلوتیناسیون لاتکس.

مقادیر طبیعی:  DNA ویروس  CMV در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست حتی اگر این افراد قبلاً در معرض عفونت قرار گرفته باشند. با سرکوب ایمنی در بیماران، ممکن است تا مدت ها میزان ویروس در خون پایین بماند ولی افزایش میزان ویروس بیان کننده فعال شدن ویروس و پیشرفت بیماری است.

محدوده قابل سنجش:  ۱۰۰ – ۲۵۰۰۰۰۰ CMV DNA copies/mL

تفسیر:

با توجه به اینکه روش های کشت ویروس سیتومگال بسیار کند است و این مسأله جهت درمان بیماران، به ویژه در مورد بیماران نقص ایمنی می تواند عواقب خطرناکی داشته باشد و روش های سرولوژیکی نیز در تفکیک عفونت حاد از عفونت مخفی چندان کارامد نیستند، لذا روشهای مبتنی بر PCR جهت تشخیص به موقع و انجام اقدامات درمانی مناسب توصیه می شود.

ردیابی پاتوژن به وسیله PCR بر اساس تکثیر نواحی اختصاصی از ژنوم ویروس صورت می گیرد. در Real time PCR محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود که این امر عموماً  به واسطه پروب های الیگونوکلئوتیدی که به طور اختصاصی به محصول تکثیر یافته متصل می شوند، صورت می گیرد. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR(یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، محصول جمع شده را ردیابی نموده و کمیت آن را تعیین نمائیم.

عوامل مداخله گر :

• هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
• نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
• فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات:

• نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA ویروس در نمونه یافت نشده است.
• نتایج کمی بیان شده به واحد copy/ml نشان دهنده میزان فعالیت ویروس و تکثیر آن در بیمار است.
• نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت CMV و یا پاسخ به درمان ضد ویروسی نظارت می کند.
• تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA ویروس در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.
• در صورت عدم ردیابی DNA ویروس در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به ویروس CMV رد نمی گردد.