Hepatitis B Virus (HBV) Quantitative by Real-Time PCR

نام اختصاری:  HBV Quantitative Real-Time PCR

سایر نام ها: اندازه گیری کمی ویروس هپاتیت  Bبا روش Real-Time PCR،  Hepatitis B Quantitation، HBV DNA Quantitation،HBV DNA detection by Real time PCR  ، HBV viral Load

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: پلاسما، سرم، بافت کبد

حجم نمونه مورد نیاز:  ۵ ml

شرایط نمونه گیری:

1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

1. لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های حاوی EDTA صورت گیرد.
2. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
3. از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
4. پس از نمونه گیری باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC 20 – نگهداری شود.
5. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
6. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
7. برای تهیه پلاسما از مواد ضد انعقاد EDTA یا سدیم سیترات استفاده شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
2. قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
3. در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد.

شرایط نگهداری:

1. پس از جدا سازی سرم یا پلاسما در شرایط استریل، باید تا زمان انجام  آزمایش، آن را در دمای ºC 20 – نگه دارید.  سرم باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری از لخته جدا شده و  به صورت منجمد نگهداری شود. بافت کبد نیز باید تا زمان انجام آزمایش های بعدی در ^oC 20 – نگهداری شود.
2. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
3. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در ۲۴ ساعت اولیه، نمونه را در ^oC 20 – فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

1. تأیید عفونت مزمن ویروس هپاتیت B ( (HBV
2. تعیین کمی HBV-DNA  سرم بیماران مبتلا به عفونت مزمن HBV (سابقاً HBsAg مثبت بوده اند.)
3. نظارت بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV

اطلاعات تکمیلی:

هپاتیت ویروسی مزمن ممکن است ناشی از عفونت با HBV یا HCV باشد. عفونت ممکن است منجر به یک حالت ناقل طولانی مدت و بیماری کبدی مزمن خفیف تا شدید شود. دو هفته پس از عفونت با هپاتیت B، می­توان مقدار زیادی از پروتئین ویروس (آنتی‏ژن سطحی ویروس) را در سرم و پس از آن پاسخ آنتی‏بادی به پروتئین‏های ویروس (anti-HBs) را ردیابی کرد. آنتی‏بادی­های ضد HBV در اکثریت بیماران برای تمام عمر پا بر جا می‏مانند. بهرحال حدود ۱۰% از عفونت‏های HBV منجر به یک حالت ناقل مزمن می‏شود که مشخصة آن فقدان anti-HBs  است ولی anti-HBc و معمولاً HBsAg  باقی می‏مانند.  تشخیص این گونه موارد باید با ردیابی  HBV DNA  در سرم یا بافت کبد تکمیل شود.

روش مرجع: Blot DNA Hybridization Based – Slot

روش ارجح: DNA Detection and Quantification by Real-Time PCR

سایر روشها:  Qualitative DNA Detection Real-Time PCR، تکثیر DNA  با استفاده از روش PCR Conventional.

مقادیر طبیعی:  DNA ویروس  HBV در نمونه های سرم یا بافت کبدی افراد سالم وجود ندارد و ردیابی نمی شود.

محدوده قابل سنجش (مثبت): IU/ml  ۱۰^۹ × ۲۵ – ۵

تفسیر:

کاوش پروبDNA ، یک اندازه‏گیری مستقیم HBV در سرم یا پلاسما را امکان­پذیر ساخته و با تیترهای آلایندگی (infectivity)  ارتباط دارد. اطلاعات حاصله از این آزمایش باید همراه با تست‏های سرولوژیک و  ردیابی HBsAg  مورد استفاده قرار گیرد HBV DNA حساس‏ترین مارکر برای عفونت جاری (ongoing) است. اندازه‏گیری کمی DNAویروس ارزش پروگنوستیک داشته و از آن به عنوان پاسخی به درمان ضد ویروسی استفاده می‏شود. همزمان با پاک شدن عفونت از بدن، سطوح HBV DNA  و HBsAg افت می‏کند. در مراحل بعدی بیماری که آمینوترانسفرازها طبیعی می‏شوند، DNA  ویروس با تکنیک‏های هیبریداسیون منفی می‏شود ولی غالباً با PCR قابل ردیابی خواهد بود. ردیابیDNAنباید جای آزمایشات سرولوژیک را بگیرد.

عوامل مداخله گر :

• هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
• نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.

توضیحات:

• نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNA ویروس هپاتیت (HBV) B در نمونه یافت نشده است.
• نتایج کمی بیان شده به واحد IU/ml نشان دهنده میزان فعالیت ویروس HBV و تکثیر آن در بیمار است.
• نتایج کمی بر پیشرفت بیماری در عفونت HBV مزمن و یا پاسخ به درمان ضد HBV نظارت می کند.
• ارزیابی آزمایشگاهی وضعیت عفونت HBV باید با آزمایشات سرولوژیک HBV آغاز گردد. از جمله، آزمایش از نظر وجود آنتی ژن سطحی هپاتیت B مورد ارزیابی قرار گیرد.
• تشخیص عفونت مزمن HBV صرفاً با حضور مقادیر قابل تشخیص و سنجش DNA  ویروس در نمونه سرم امکان پذیر نیست.
• در صورت عدم وجود DNA ویروس در نمونه سرم بیمار و مثبت بودن Anti HBs، احتمال آلودگی به ویروس HBV رد نمی گردد.